抗体産生促進因子(IPSF)


はじめに

 ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は生物学や医学にとどまらず、様々な領域において今や必要不可欠なタンパク質である。生物学の分野においては、細胞膜抗原の分類・定量・精製、微量物質の高感度の検出試薬、さらにはアフィニティークロマトグラフィーのリガンドとして用いられている。また、医学の分野では様々な疾病に対する体外診断薬として広く利用されており、今後、体内診断薬や治療薬としての応用が強く期待されている。抗体はその分子中に糖鎖を持つ糖タンパク質であり、その糖鎖は細胞内外での情報伝達、分子認識などの重要な生物機能の発現に関わるとともに、抗体の種特異性の発現、および生体内での安定性の調節に関与している。従って、生物機能を保持した抗体の生産には糖鎖修飾機能を有する真核細胞を、ヒトの生体内において拒否反応を示さないヒト抗体の生産にはヒト型ハイブリドーマを用いる必要がある。しかし、ハイブリドーマ、特にヒト型ハイブリドーマの生産性の低さがヒト型モノクローナル抗体の十分な供給、および生産コストの低減を妨げる大きな要因となっている。  動物細胞による物質生産を効率よく行うには、二つの方法がある。一つは細胞を大量にかつ高密度に培養すること。もう一つは、細胞の生産性を高めることである。細胞の生産性を高めるには、遺伝子組み換え技術を用いて転写活性を高めるなど遺伝子レベルで生産性を増強する方法と、培地成分を含めた培養環境を至適化する方法とがある。ここでは、モノクローナル抗体の産生を促進する因子による産生増強について述べることにする。

 生体内において抗体を産生する細胞はBリンパ球が最終段階まで成熟した形質細胞であり、その抗体生産能力は非常に高い。形質細胞は生体内において細胞1個あたり1日におよそ1.7x10^8個の抗体分子を生産する能力を持ち(Warner, 1974)、これをIgG抗体に換算すると43 pgに相当する。すなわち、2x10^7 cells/mLの細胞密度で1リットルの高密度培養装置を用いれば1日に860 mgのIgGの生産が可能であるという計算になる(Murakami H, 1990)。また、マウス骨髄腫細胞株であるMPC-11細胞は、最大速度で1分間に5 pgのIgGを生産するとされている。これは、100万個のMPC-11細胞が1日に7.2 mgのIgGを生産することを意味している(Murakami H et al., 1991)。このことは、動物細胞も物質生産において非常に高いポテンシャルを持ち、必ずしも微生物に劣るものではないことを示している。しかし、実際の培養系ではハイブリドーマのモノクローナル抗体生産性は非常に低いレベルにとどまっており、MPC-11が実際に産生するIgG量は1日あたり10 μg/10^6 cellsにすぎない。この培養系における生産性の低さは何が原因であろうか。その理由の一つは、培養環境にあり、現在用いられている培地や培養条件、特に無血清培地がハイブリドーマの持つ生産能を十分に引き出してはいないのではないかと考えられる。そこで、無血清培養下においてハイブリドーマのモノクローナル抗体生産性を増強する抗体産生促進因子(Immunoglobulin Production Stimulating Factor ; IPSF)を検索し、モノクローナル抗体生産性の増強を試みた。

動物細胞由来の抗体産生促進因子

 抗体産生促進因子が最初に見いだされたのは培養細胞の細胞質抽出液中であった。肺腺ガン細胞株であるPC-8細胞の細胞質抽出液をヒト型ハイブリドーマの培養液に添加すると、モノクローナル抗体の生産量の増加が認められた(Shinmoto et al., 1988)。また、ヒトリンパ芽球様細胞株HO-323細胞の培養上清中に分子量410 kDを持つ抗体産生促進因子、IPSF-Iが確認された(Toyoda et al., 1990)。IPSF-Iは複数のサブユニットからなるタンパク質で、ヒト型およびマウス型ハイブリドーマのIgM生産性を促進する。さらに、ヒトバーッキトリンパ腫細胞株のNamalwa細胞の細胞破砕液中にIPSF-IIの存在が確認された(Yamada et al., 1989a)。Namalwa細胞破砕液はIPSF-IIαと-IIβの異なる二種類の活性因子を含んでいた。精製の結果、IPSF-IIαは分子量40 kDaのサブユニット1分子と36 kDaのサブユニット2分子からなる112 kDaのタンパク質であり、活性サブユニットは36 kDのタンパク質であった。IPSF-IIαは無血清培地に1μg/mlの添加でヒト型ハイブリドーマのIgM生産性を約8倍、マウス型ハイブリドーマのIgM生産性を約2倍促進した(Sugahara et al., 1991a)。IPSF-IIαの36 kDaタンパク質のN末端アミノ酸配列の解析および相同タンパク質の検索の結果、36 kDaサブユニットは解糖系酵素であるグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)であることが確認された(Sugahara et al., 1991b)。GAPDHのハイブリドーマに及ぼす抗体産生促進効果の発現にはGAPDH活性は関与しておらず、IPSF活性が本酵素の新規生理活性であることが明らかとなった。GAPDHのIPSF効果が培養開始直後から観察されることから、抗体タンパク質をコードするmRNAの安定化による産生促進といった間接的な効果ではなく、タンパク質生合成系を直接促進しているのではないかと考えられた。そこで、モノクローナル抗体の生合成のどの段階を促進しているかを検討した。転写阻害剤であるアクチノマイシンDで処理して転写活性を阻害したハイブリドーマにGAPDHを作用させたところ、IPSF効果の低下は全く認められず、モノクローナル抗体の生産を強く促進した(Sugahara et al., 1995)。しかし、シクロヘキシミド処理で翻訳活性を阻害したハイブリドーマに対してはIPSF活性を示さなかった。これらの結果は、GAPDHの作用点が転写段階以降にあることを示唆している。GAPDHは、DNAやRNAなど、核酸に対する親和性を有していることが報告されている(Perucho et al., 1980、Ryazanov, 1985)。そこで、ポリヌクレオチド共存下におけるGAPDHのIPSF活性を検討した。その結果、DNAや合成ポリリボヌクレオチドとの共存によりIPSF活性が阻害を受けることが明らかとなった(Sugahara et al., 1998a)。その理由については現在検討中である。

 一方、IPSF-IIβは、硫酸アンモニウムによる塩析、疎水クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、さらにゲルろ過による精製の結果、46 kDの分子量を持つタンパク質であることが判明した(Sugahara et al., 1992)。この46 kDタンパク質の部分アミノ酸配列を検討した結果、種々の生物由来のエノラーゼと非常に相同性が高いことが明らかとなった。ウサギ筋肉由来のエノラーゼのIPSF活性を検討した結果、IPSF-IIβにくらべ、タンパク質量あたりの比活性は低いもの、220μg/mlの添加で20倍の産生促進活性を示した。逆にIPSF-IIβもエノラーゼ活性を有しており、IPSF-IIβはエノラーゼであると同定された。IPSF-IIβは、ヒト型およびマウス型の種々のハイブリドーマ、さらに末梢血リンパ球のIgMおよびIgG産生を促進した。ウサギ筋肉エノラーゼを用いてIPSF-IIβの作用機構を検討したところ、GAPDHと同様にその解糖系酵素としての酵素活性はIPSF活性の発現には関与しておらず、酵素活性とは独立した生理機能であった(Sugahara et al., 1998b)。トリプシン処理による部分分解や加熱処理などにより容易にIPSF活性の消失が起こることから、立体構造の保持が活性発現に必要であると考えられる。また、GAPDHの場合と同様に、エノラーゼも転写を阻害したハイブリドーマに対してIPSF活性を示し、作用点が転写以降であることが示唆された。しかしGAPDHとは異なり、シクロヘキシミド処理したハイブリドーマに対しても強いIPSF活性を示し、GAPDHとは異なる作用による効果であることが示唆された。さらに、ゴルジ装置における新生タンパク質の移送を抑制するモネンシンでハイブリドーマを処理すると本酵素のIPSF効果の低下が認められたことから、本酵素は翻訳段階の活性化に関与しているのではないかと考えられる。また、エノラーゼはハイブリドーマ内部へ取り込まれていることが確認された。細胞内部への取り込みとIPSF活性の発現との相関性に関しては現在検討中である。

塩基性タンパク質による抗体産生の促進

 核酸結合性タンパク質であり、塩基性タンパク質でもあるヒストンに抗体産生促進活性が認められた。ヒストンのうち、高リジン型ヒストンであるH1、H2A、およびH2BにはIPSF活性が認められたが、高アルギニン型ヒストンであるH3、H4には効果がみられなかった(Sugahara et al., 1994)。一方、高アルギニン含量を持つプロタミンはわずかにIPSF活性を示した。これらの結果をもとにポリリジン及びポリアルギニンのIPSF活性を検討したところ、ポリリジンには効果が認められたものの、ポリアルギニンにはほとんど促進効果が認められなかった。また、ポリリジンのIPSF活性はポリ-L-リジンのみならず、ポリ-D-リジンにも認められることから、リジン残基の持つ静電気的な性質がIPSF活性の発現に寄与しているとのではないかと考えられる。

 先に述べたGAPDHやエノラーゼも等電点(pI)がアルカリ側にある塩基性タンパク質である。特に、エノラーゼにおいてはウサギ筋肉由来のエノラーゼ(pI=8.8)にはIPSF活性が認められるものの、等電点が酸性側にある酵母由来のエノラーゼ(pI=5.7〜7.1)はIPSF活性を有していなかった(Sugahara et al., 1998b)。同様のことがGAPDHにも認められたため、因子の塩基性がIPSF活性の発現に大きく関与しているのではないかと推察した。そこで、塩基性タンパク質についてIPSF活性のスクリーニングを試みた。その結果、ウマ肝臓由来アルコール脱水素酵素(Sugahara et al., 1997Okamoto et al., 1999Okamoto et al., 2001)、ニワトリ卵白リゾチーム(Murakami F et al., 1997Sugahara et al., 2000)およびウサギ筋肉由来アルドラーゼ(Sugahara et al., 1999)にもIPSF活性が認めらた。これら抗体産生促進因子はハイブリドーマだけでなく、ヒト末梢血由来の正常リンパ球のIgMおよびIgG産性も促進した。

ポリアミンによる抗体産生の促進

 塩基性のタンパク質やポリアミノ酸に広くIPSF活性が認められたことから、塩基性の低分子化合物に注目した。低分子IPSFはこれまでのタンパク質性の高分子IPSFに比較してその実用性は高く、高生産用の無タンパク培地の開発も可能となる。そこで、低分子塩基性化合物としてポリアミン類に着目し、様々なポリアミンについてIPSF活性を検討した。その結果、生体アミンとして知られるスペルミンが抗体産生を促進することが明らかとなった(Miyazaki et al., 1998)。スペルミンは分子量202の直鎖状脂肪族炭化水素であり、DNAやRNAの安定化、核酸合成系の促進、タンパク質合成系の促進などの効果が知られている(Fillingame et al., 1975、Flink et al., 1975)。スペルミンの効果を検討した結果、7.3 mMの添加によりハイブリドーマのIgM生産性が6倍向上した。スペルミンによる効果は細胞増殖の促進を伴わず、また、スペルミン添加によりハイブリドーマの細胞内抗体含量がコントロールに対して明らかに増加していたことから、スペルミンが抗体の生合成を促進していることが示唆された。ヒト末梢血リンパ球に対しては、0.8 mMの添加でIgM産生を1.8倍促進したが、IgG産生については効果が認められなかった。また、70 μg/mlのDNAとの共存によってスペルミンのIPSF効果が2倍になった。スペルミンは核酸との結合性を有しており(Igarashi et al., 1975、Ikemura, 1969)、DNAとの結合がスペルミンのIPSF活性の発現に何らかのかたちで関与しているのではいかと考えられる。

 スペルミンの類縁化合物である、スペルミジン(Spermidin)、テルミン(Thermine)、トリエチレンテトラアミン(Triethylenetetraamine)にも産生促進活性が認められたが、強塩基性のため細胞障害性が強く、長期間の培養では細胞の生存率低下が認められた。

食品由来の抗体産生促進因子
 

 様々な食品成分中にもハイブリドーマやリンパ球の抗体産性を促進する効果がある物質が含まれていることが知られている。ニワトリ卵黄中に含まれている低密度リポタンパク質成分であるYLP(Yolk Lipoprotein)は無血清培地において様々な細胞の増殖を支持するとともに、ハイブリドーマやリンパ球の抗体産生を強く促進する(Yamada et al., 1989b)。また、YLPの産生促進効果はローヤルゼリーとの共存で9倍向上することから、食品成分の協同的な作用により個々の効果が飛躍的に向上する可能性を見いだした(Yamada et al., 1990)。乳中に含まれるラクトフェリンやカゼインもヒトおよびマウス由来のハイブリドーマの抗体生産性を3〜8倍促進する。カゼインについては、α-、β-、κ-のそれぞれのカゼインが増殖促進効果とIPSF効果をもち、細胞あたりの抗体生産性はおよそ6倍向上した(Yamada et al., 1991)。

 近年アトピー性皮膚炎などに対する薬理効果が注目されているコメ発酵エキスにもヒト末梢血リンパ球のIgM生産性を約3倍促進する効果が認められた(Sugahara et al., 1996)。コメ発酵エキスをクロロホルム-メタノール(1:1)で抽出したところ、クロ-メタ相に活性が回収されたことから、本活性因子はタンパク質ではなく、脂質に関連した化合物であることが予想される。

おわりに

 以上示したように、IPSFとして同定された因子の多くが塩基性を帯びたものであった。今後、この塩基性とIPSF活性との関連を解明する必要があると考える。また、その作用機構を考えた場合、IPSFが抗体タンパク質の生合成に対して特異的に作用しているとは考えにくい。これまでに、IPSF-IIαとして同定されたGAPDHが骨肉腫細胞株のインターフェロン産生を促進することが確認されており、他のタンパク質の生産系に対する効果についても広く検討する必要がある。また、食品中のIPSFを考える場合、アレルギーとの関連を考慮に入れ、リンパ球のIgE産生に対する効果を検討する必要がある。


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